离子交流层析介质的应用

宣布时间：2020-04-27

离子交流层析疏散纯化生物大分子的历程，主要是使用种种分子的可离解性、离子的净电荷、外貌电荷漫衍的电性差别而举行选择疏散的。现已成为疏散纯化生化制品、卵白质、多肽等物质中使用最频仍的纯化手艺之一。

1. 离子交流剂的选择

在举行疏散纯化时，要求层析柱具有高负载量、易于操作及使用寿命长等特点，其中疏散介质是最主要的影响因素，因此，疏散介质的选择尤为主要。

1.1 品种的选择：

应凭证被疏散纯化目的产品所带电荷的种类、分子的巨细、物理化学性子及所处的微情形等因素，选择相宜的离子交流层析介质。关于无机小分子而言，疏散介质的选择相对容易，但关于生物大分子就必需思量更多的因素。

卵白质等生物大分子是由多种氨基酸所组成的，在差别的pH条件下显示差别的电性，而生物大分子对最相宜的pH情形具有特定的要求，因此，必需首先相识目的卵白的等电点及相宜的微情形，凭证这些条件选择合适的离子交流剂种类。

是选择阳离子交流剂照旧选择阴离子交流剂，主要取决于被疏散的物质在其稳固的pH 下所带的电荷，若是带正电，则选择阳离子交流剂；如带负电，则选择阴离子交流剂。例如待疏散的卵白等电点为4，稳固的pH 规模为6~9，由于这时卵白带负电，故应选择阴离子交流剂举行疏散。

1.2 骨架的选择：

应凭证目的产品的产量、要求抵达的纯度及经济价值等因素，选择合适骨架（基质）的离子交流剂。

通用型的聚苯乙烯离子交流树脂具有结构稳固、价钱低廉、全交流容量高等特点，适用于如抗生素、有机酸、动物资源或植物资源的有用因素等一样平常生化制品的提取疏散工艺。而关于要求区分率高、制品纯度高的一些高附加值的基因工程产品，仍需使用纤维素、葡聚糖、琼脂糖为基质的生化疏散专用介质。

纤维素离子交流剂价钱较低，但区分率和稳固性都较低，适于起源疏散和大宗制备。葡聚糖离子交流剂的区分率和价钱适中，但受外界影响较大，体积可能随离子强度和pH 转变有较大改变，影响区分率。琼脂糖离子交流剂机械稳固性较好，区分率也较高，但价钱较贵。

理想的疏散介质应该不但易于吸附，还要易于洗脱，若是目的产品关于离子强度和pH值的转变不敏感，可以思量接纳高电荷密度的强酸性或强碱性的强型介质。若是对这些因素较量敏感，则应接纳弱酸性或弱碱性的弱型介质。若是大分子物质被吸附后，团结较量牢靠，往往难以洗脱，接纳苛刻的条件又容易引起大分子的变性，则应选用功效基团密度低的介质。

强酸性或强碱性的强型介质，适用的pH 规模广，常用于疏散一些小分子物质或在极端pH 下的疏散，但由于电性较强，有时易使一些敏感的生物分子变性或失活。弱酸性或弱碱性的弱型介质，其选择性有较大的规模，且不易使卵白质失活，故一样平常适用于疏散卵白质等大分子物质，但其适用的pH规模较窄。

1.3 粒径的选择：

疏散介质粒径的巨细对离子交流层析柱的区分率和流速有显着的影响。一样平常来说疏散介质的粒径小，区分率高，但平衡离子的平衡时间长，流速慢；粒径大则柱的流速较快，压降小，但区分率低，负载量也较小。以是大颗粒的疏散介质适合于对区分率要求不高的大规模制备性疏散，而小颗粒的疏散介质适合于需要高区分率的细腻疏散或产品的精制阶段。

2. 操作中注重事项

2.1 预处置惩罚：

在离子交流剂的工业产品中，常含有少量的有机低聚物及一些无机杂质，在使用初期会逐渐溶诠释放，影响目的产品的质量。因此，工业级离子交流剂在使用前必需举行预处置惩罚。

通用型的离子交流树脂通常使用酸、碱举行处置惩罚，可接纳1~2 mol/L的盐酸及氢氧化钠溶液，以4~6倍树脂床体积交替举行处置惩罚，在酸及碱处置惩罚之间须用去离子水洗至中性。关于大孔型的树脂，还需要用乙醇、丙酮等有机溶剂举行处置惩罚，以除去生产历程中所用的有机物剩余物。对疏散介质举行预处置惩罚，不但能提高其事情容量，更可提高被疏散产品的纯度。经预处置惩罚后的树脂，最后应转为疏散历程中适用的离子型态。

关于生化专用的离子交流剂，以多糖类骨架为主的介质，一样平常贮保存20%的乙醇中。为了疏散介质在疏散历程中只管镌汰pH值的转变，需要用大宗的去离子水举行洗濯，然后用缓冲液举行平衡。

疏散介质的预处置惩罚可以在柱内举行，也可以在烧杯等容器中举行。在柱内举行预处置惩罚时，或溶液系统改变及操作温度转变时，经�；岱浩鹌�，尤其在使用内径较小的柱时。气泡一经泛起，必需实时扫除，不然对层析工艺有显着的影响。

2.2 缓冲液平衡介质：

pH值是离子交流层析的操作中的一个主要因素，而pH的稳固及改变通常是用缓冲液来实现的，以是缓冲液的选择是影响疏散效果的主要因素。

在选择缓冲液时，pH和离子强度是两个要害性的因素，它不但影响到疏散介质对目的产品与杂质的疏散效果，并且还影响到产品的收率。选用的pH值取决于目的产品的等电点、稳固性和消融度，不但要使被疏散的物质成为可以举行交流的离子，还要维持其较高的活性。同时也应该思量到离子交流剂的pK值。

由于缓冲液自己带电，以是也会与离子交流层析介质团结。这种团结将带来两方面的滋扰，一方面降低缓冲液的浓度，进而降低了缓冲能力；另一方面是与疏散介质举行交流，从而与卵白质竞争介质的交流容量。因此，在使用阴离子交流层析介质时，要阻止接纳磷酸盐之类的带负电的缓冲液，在使用阳离子交流层析介质时，则要阻止接纳Tris之类的带正电的缓冲液。由于疏散介质的种类差别，起始历程也略有差别，在通常情形下，使用阴离子交流层析介质时，起始缓冲液要高于目的卵白等电点0.5 ~ 1 pH值；使用阳离子交流层析介质时，则起始缓冲液要低于目的卵白等电点0.5 ~ 1 pH值。

2.3 层析柱的操作：

2.3.1 操作方法：

由于生化疏散的样品、缓冲液和洗脱液都是流动相，可在流经柱时举行疏散，因此，离子交流可以接纳柱式操作，以层析形式举行疏散。在疏散历程中，未被吸附的物质一直流出反应系统，使平衡一直右移，是一种动态平衡，以是也称为动态操作。动态操作方法疏散效果好，适用于种种样品，可实现一连操作。在层析疏散的操作中，层析柱的装填情形对疏散有一定的影响，介质在柱内要漫衍匀称，尤其不允许气泡的保存，也应避免介质爆发分层征象。

关于一些粘度较大的样品，举行起源提取疏散时，也可以接纳“静态”处置惩罚要领，经离子交流剂与需处置惩罚的事情液在反应容器中举行搅拌，当抵达吸附平衡后，将介质与残液疏散，装入柱中举行洗脱。这种静态分批操作的要领，工艺装备简朴，操作轻盈，如肝素钠等一些自然产品的起源疏散，往往接纳这种静态疏散方法。在静态疏散方法的操作中，应适当控制离子交流剂在事情液中的搅拌速率，若搅拌速度过快，剪切力过大，会造成离子交流颗粒的破碎，难以举行过滤疏散；但若搅拌速度过慢，则影响介质与事情液的接触，也影响交流速率。

2.3.2 柱式操作的种类：

牢靠床疏散：在柱式操作中，料液作为流动相，在柱内自上而下地流动，在流动的历程中举行吸附。为了获得较好的疏散效果，对疏散柱有三点最基本的要求：疏散柱底部要有孔径漫衍匀称的筛板，以避免流动相爆发偏流；疏散柱支持层下端的死角体积要只管地小，以避免疏散历程中色谱带混淆或扩展；无论巨细，疏散柱都必需坚持笔直。在牢靠床操作中，可以举行正向洗脱，也可以举行逆向洗脱，一样平常情形下，逆向洗脱或再生可获得较好的效果，但对操作有较为严酷的要求。

流态床：流动的料液从柱的下端流入，从上端流出，疏散介质在柱内呈流态状。此种疏散要领对操作有严酷的要求，一样平常较少应用，洗脱方法以接纳正向洗脱为好。

2.3.3 事情液对疏散效果的影响：

为了使生化疏散抵达高区分率及高负载量，事情液的制备及性能也是很是主要的因素。事情液的粘度、澄清度等不但影响离子交流剂的疏散效果，还影响到疏散介质的使用寿命。生化疏散往往是一个较量重大的系统，其中有多种杂质保存，不但有简朴的小分子，尚有一些胶体物质、脂类物质等，尤其是一些不可逆吸附的大分子往往包裹笼罩了介质的功效基团，或梗塞了介质的孔道，造成不可逆污染，缩短疏散介质的使用寿命。因此，在疏散操作前，应只管将事情液举行适当的预处置惩罚，以确保疏散的效果。

在生化疏散纯化历程中，由于淋洗历程带走了一些目的产品，或因洗脱不完全而使目的产品滞留在介质上，造成产品的损失，是影响产品收率的主要因素，同时，卵白质的结构转变引起失活，也将影响活化收率。在离子交流历程中加入一些稳固剂或�；ぜ�，不但可以提高收率，还可提高疏散介质对卵白质的选择性。

2.3.4 流速对疏散效果的影响：

离子交流层析疏散中，流速是影响疏散效果的一个主要因素。为了获取优良的疏散效果，应凭证离子交流剂的种类、粒径、事情液中有用因素的分子结构等因素，举行试验，以确立较佳的试验参数。若目的产品的分子量相对较量小，且介质的孔径较量大时，由于有利于传质作用，可接纳较高的流速。而关于目的产品为生物大分子，且介质的孔径相关于被疏散物质分子较小时，由于分子的扩散速率较慢，则宜接纳较慢的流速。在事情液的粘度较大时，因传质速率较低，也应接纳较低的流速。

流速不但影响交流吸附的效果，也影响洗脱的效果，通常情形下，洗脱时的流速要比交流吸附时慢些。

2.4 介质的洗脱、再生方法：

当离子交流剂失效后，应举行洗脱，其基来源理是用一种比吸着物质更生动的离子或基团，把交流吸附到介质颗粒外外貌和内部的目的产品解吸下来。吸着物差别，其生动性差别，因此，应选择合适的洗脱剂，将卵白质从介质上洗脱下来，网络疏散纯化的产品。

离子交流层析大致有三种洗脱方法：

一种为同步洗脱。洗脱剂是统一种物质，可接纳稀的酸、碱或盐类溶液，也可选用适当的有机溶剂，其中以盐溶液为主，依据目的产品的性子及最终获得产品的剂型举行选择。由于被吸着的物质往往不是简单的品种，种种物质所带的电荷电量差别，与介质的团结强度差别，纵然使用统一种洗脱剂，容易被替换的物质先脱离介质流出，结协力较强的物质后流出，只要通太过级网络，就可以把种种物质疏散，获得较纯净的产品。这种要领多用于对目的产品的性能相识很清晰时的疏散，或用于剖析类的疏散。

第二种为分步洗脱，即划分用差别浓度的盐溶液举行洗脱。疏散介质在交流吸附历程中，会有多种卵白质被吸附，若是接纳一个恒定的洗脱条件，有时不可将所有的组分适外地脱离，需要改变洗脱条件�？梢允墙锥问降母谋�，即选用差别的洗脱剂或差别pH值的洗脱剂分阶段举行洗脱，可以凭证洗脱液差别的浓度、差别的酸度获得差别的洗脱峰。即一种盐浓度可以获得一种目的卵白，差别的盐浓度可以获得差别的目的卵白。这种分步洗脱的方法，适用于已知性子卵白的疏散，尤其适用于规模生产中，操作利便，易于控制。

第三种为一连的梯度洗脱，即按一定的线性转变改变洗脱液的离子强度或pH值（一样平常只在特殊情形下使用改变pH值的洗脱方法），在洗脱剂渐变的历程中，将差别的卵白质逐一置换，可获得州差别的卵白组分，同时，卵白质一样平常不拖尾。梯度洗脱是离子交流层析中最常用的洗脱方法，也是洗脱能力相对最强的洗脱方法，适合于对电荷性子相近组分的洗脱。

在洗脱历程中，顺流洗脱或逆流洗脱均可接纳，顺流洗脱也称为正向洗脱，即洗脱液的流动偏向与事情液的流动偏向相同，逆流洗脱也称为反向洗脱，即洗脱液的流动偏向与事情液的流动偏向相反。若料液是自上而下正向通过交流柱举行交流吸附的，则交流柱上层吸附物的浓度要比下层高，洗脱液自下而上反向解吸可以更高效地抵达洗脱的目的。但由于逆向洗脱的操作要比正向洗脱重大得多，故现在多以正向洗脱为主。

洗脱液的流速也会影响离子交流层析疏散的效果，洗脱速率通常要坚持恒定。一样平常来说，慢速洗脱的区分率要比快速洗脱好，但洗脱速度过慢，会造身疏散时间长，样品扩散、谱峰变宽、区分率降低等副作用，以是要凭证现真相形选择合适的洗脱速率。若是洗脱峰相对集中于某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度规模或降低洗脱速率来提高区分率。若是区分率较好，但洗脱峰过宽，则应适当提高洗脱速率。

2.5 介质的消毒：

在某些纯度要求较高的生化产品制备历程中，往往要求对疏散介质举行消毒处置惩罚，以避免微生物等杂质混入目的产品中。

接纳高温消毒是最常用的要领，现在大大都离子交流剂具有稳固的物理化学性能，均可举行高温消毒处置惩罚。但在使用多糖类介质时，必需注重，介质一定要处于盐型，并且要在中性条件下才华举行高温消毒处置惩罚，不然将会导致多糖大分子骨架的降解，严重影响介质的使用寿命。

NaOH也是一种很好的消毒剂，但要凭证介质的耐碱水平和微生物污染的种类、污染水平选用合适浓度的NaOH。这种消毒要领也可以接纳柱内浸泡法，即将一定浓度的NaOH通入柱中，关闭出液阀，浸泡几个小时后，可抵达消毒的目的。NaOH若是与乙醇适用，可以获得更佳的效果。用NaOH消毒还可将消毒和在位洗濯合并处置惩罚。

2.6 介质的“苏醒”：

在生化疏散历程中，由于疏散系统较为重大，含有多种卵白质或其他杂质，因此在使用历程中常泛起树脂的“中毒”征象。中毒缘故原由可能是由于大分子的多点带电，与介质举行多点团结，致使难以洗脱，使介质的有用功效基团镌汰。也可能是一些较大的分子被“卡牢”在孔道内，难以扩散出来，梗塞了孔道，在以后的交流历程中影响到颗粒内功效基团的有用事情。除生物大分子外，色素及腐殖酸等都可使介质中毒。有时势情液中的胶状物质被粘附于介质颗粒的内外外貌，笼罩了功效基团，这也是影响介质事情容量的主要因素。

由于上述缘故原由，离子交流层析介质在使用一段时间后，可能泛起颜色变深、床体缩短、区分率下降、卵白质收率降低、反压升高等征象。此时，需要对介质举行净化处置惩罚。关于介质用量较量大，自动化水平较量高的规模生产，应接纳在原交流柱内举行，即“在位洗濯”。先从交流柱的下面通过适量的清水，目的是去除交流柱中的悬浮物，并将床体松散，还可以将结块的介质疏散，有利于以后介质与洗濯液的接触。关于一样平常的污染，接纳逆流洗濯，可镌汰污染物对下层介质的污染。应凭证介质种类及污染水平的差别，划分选用差别种类的洗濯剂及差别的洗濯办法。一样平常的介质是用2mol/L的NaCl、1mol/L的NaOH、0.1mol/L的HCl或1mol/L的HCl溶液交替分阶段洗濯或浸泡，各试剂交替之间须用去离子水洗至中性。若经由上述处置惩罚后仍无显着改善，尤其是流速无显着提高，则要检查交流柱布水器的纱网是否泛起梗塞。

上述历程即为通常所说的“苏醒”历程。差别的介质应选用差别的苏醒要领，主要取决于介质的物理化学性能及污染物质的性子。关于多糖类的离子交流剂，每当使用一段时间后，可接纳离子浓度较大的缓冲液通过交流柱或浸泡介质，由于缓冲液的离子强度较大时，有利于卵白质大分子脱离介质，抵达苏醒的效果。关于物化结构稳固的介质，也可使用NaCl溶液通过交流柱或浸泡介质。关于物化结构很是稳固的介质，可用30℃~40℃的乙醇或丙酮举行洗脱或浸泡，在高温下可使吸附在介质上的卵白变性或加速扩散速率，也有利于胶体物质的破损，从而使污染物脱离介质�；箍稍谝掖蓟騈aOH溶液中加入NaCl，更有利于介质的苏醒。

扫除沉淀卵白、脂类、疏水性的卵白及脂卵白，处置惩罚办法更为重大�？山幽�100%的异丙醇、20%的乙腈、2mol/L的NaOH溶液、75%的乙酸、20%的乙醇、100%的甲醇或6mol/L的盐酸胍、阳离子或非离子洗涤剂等作为处置惩罚液。在用过这些洗濯剂后，都要用至少2倍体积的蒸馏水举行洗濯。使用有机溶剂后，交流柱要接纳锯齿形的梯度洗涤举行洗濯，即可以在5倍床体积内，使溶剂的含量从0增至100%，然后在下一个5倍床体积中，使溶剂的含量从100%降到0。

若是经由上述处置惩罚，交流柱的事情情形仍没有恢复，可以使用卵白水解酶，将仍滞留在介质内的卵白质举行水解，使其脱离介质�？梢越幽珊�1mg/mL胃卵白酶的0.1mol/L 乙酸溶液及0.5 mol/L 的NaCl溶液注入到交流柱中，在室温下浸泡住宿，或在37℃下浸泡一小时。凭证污染物的情形，也可以接纳DNA酶等其它的酶类。无论使用哪一种酶处置惩罚后，都要重复上述扫除污染物的洗濯办法，把酶洗濯清洁。

脂卵白对疏散介质的污染较量严重，由于脂卵白及其它脂类物质，很容易粘附在层析柱内，最幸亏举行疏散工艺前先将其去除。推荐使用硫酸葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮等沉淀剂，可去除高含量的脂卵白。

2.6 介质的贮存：

种种疏散介质在使用后都要举行洗濯后再贮存，这关于多糖类疏散介质尤为主要。疏散介质在使用后，先用2个床体积的清水洗濯，然后用2个床体积的20%的乙醇过柱。关于SP强酸性阳离子介质，要用含有0.2mol/L乙酸钠的20%乙醇溶液洗濯，再用脱气的乙醇-水溶液以较慢的流速洗濯。经由处置惩罚后，可在室温下贮存，或在4~8℃下恒久存放。贮存历程中必需将层析柱所有关闭，以避免水分的挥发，造成干柱。暂时不必的介质必需贮保存20%的乙醇溶液中。所有的离子交流疏散介质，都要在4℃~30℃的条件下贮存，并避免冷冻。